HGH Kigtropin

Описание анализируемых образцов:

Образец 1

Стеклянный завальцованный флакон (3 мл), с синей крышкой (рисунок 1).

Маркировка на бумажной этикетке:

10 IU (3.7 mg) / 1 ml / vial l.m./s.

KIGTROPIN

Recombinant Human Growth Hormone for Injection.

Batch No: 20130220-08

Exp. Date: 20150120

Storage: Store at 2-8 C in refrigerator

кигтропин1

Рисунок 1 – Образец 1, внешний вид упаковки и флакона (фотография)

 

 

Справочная информация по соматотропину

Name: Somatropin recombinant

Accession number: DB00052 (BIOD00086, BTD00086)

Type: biotech

Description: Recombinant human growth hormone (somatotropin) 191 residues, MW 22.1 kD, synthesized in E. coli

Брутто-формула: C990H1532N262O300S7

Средняя молекулярная масса: 22129.0000

Аминокислотная последовательность:
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPT

PSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEG

IQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF

 


 

Подготовка образцов для анализа

К образцу Kigtropin добавили 1 мл воды. Ожидаемая концентрация соматотропина в образце Kigtropin – 3.7 мг/мл.

Образец растворился хорошо, с образованием прозрачного раствора. При сильном встряхивании пенообразования не наблюдалось, что не характерно для белковых растворов (рисунок 2).

кигтропин2

Рисунок 2 – Вид анализируемого образца (дно флакона после растворения в воде и взбалтывания). Образец Kigtropin не пенится, что не характерно для белковых растворов.


 

Электронная спектроскопия

В качестве сравнения использовался препарат Ansomone (2013.08.09). Для полученных растворов (ожидаемая концентрация раствора Kigtropin – 3.7 мг/мл) записаны электронные спектры поглощения в диапазоне 210-700 нм (длина оптического пути 1 мм). Результаты представлены на рисунке 4. Спектр образца Kigtropin не имеет характерного для белковых растворов пика при длине волны 280 нм. Следовательно, образец Kigtropin не содержит веществ пептидной/белковой природы, а, следовательно, и соматотропина.

 кигтропин3

 

Рисунок 3 – Электронные спектры поглощения водных растворов образцов соматотропина Ansomone и Kigtropin.

 


 

Масс-спектрометрия образцов

Пробоподготовка:

К 1500 мкл смеси ACN:H2O (1:1), содержащей 0.2% муравьиной кислоты добавили 20 мкл водного раствора образца Kigtropine с предположительной концентрацией  (разбавление 76х).

Соответствующий масс-спектр представлен на рисунке 5. Используя последовательность соматотропина (из базы данных DrugBank) и программу QualBrowser из пакета Xcalibur проведена симуляция ESI масс-спектра соматотропина (параметры: adduct — H, charge: most abundant=17, half width=3), представленная на рисунке 5. Сравнение рисунков 5 и 7 подтверждает наличие в образце 1 соматотропина. Образец Kigtropin не содержит соматотропин, либо содержит его в очень низком количестве (не более 10 мкг на флакон).

 кигтропин4

Рисунок 4 – Масс-спектр образца Kigtropin (ожидаемая концентрация 49 мкг/мл, объем инжекторной петли 2 мкл).

Для симуляции масс-спектров использовали аминокислотную последовательность соматотропина (рекомбинантный соматотропин человека) из БД DrugBank:

FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF

 кигтропин5

Рисунок 5 – Компьютерная симуляция масс-спектра соматотропина с использованием в качестве исходных данных последовательности из БД DrugBank (http://www.drugbank.ca/drugs/DB00052), основной ион +17 соответствует m/z 1302,48.

Электрофорез

Проведен электрофорез в 12% ПААГ в денатурирующих условиях.

Подготовка образцов: 1, 5, 15 мкл водного раствора образцов + 30 мкл восстанавливающего буфера для нанесения. На дорожку наносили 15 мкл полученной смеси.

1 – Ansomone

2 – Kigtropin

3 — Jintropin

 

Результат: электрофореграмма представленная на рисунке 8. На дорожках, соответствующих образцу 1, видна четкая полоса, соответствующая соматотропину. В образце 2 соматотропин отсутствует, отсутствуют также и другие соединения белковой и пептидной природы.

 

Полоса, соответствующая соматотропину

кигтропин6

Рисунок 6 – Электрофореграмма анализируемых образцов соматотропина. На дорожки слева направа нанесены: 1 – стандарты молекулярных масс белков; 2-4 – образец Ansomone; 5-7 – образец Kigtropin,8-10 – образец Jintropin.

 


 

Заключение

Проведен анализ образца Kigtropin. Для анализа использованы методы электронной спектроскопии, масс-спектрометрии и электрофореза. Для сравнения использовались результаты анализа препарата соматотропина Ansomone, 10 IU (ANHUI ANKE BIOTECHNOLOGY (GROUP) CO., LTD) (2013.08.09).

Образец Kigtropin соматотропина не содержит и является фальсификацией