HGH Джинтропин

Определение соматотропина (гормона роста) в образце

Описание анализируемого образца:

Стеклянный завальцованный флакон (3 мл), с зеленой крышкой (рисунок 1). Маркировка:

Somatotropin (rDNA origin) for injection.

JINTROPIN

GeneScience pharmaceutical Co., Ltd.

Batch No: 2012.01.12

Exp. Date: 2013.12

10 IU (3.7 mg) / 1 ml / vial

 Джинтропин

Рисунок 1 – Анализируемый образец (фотография)

 

Подготовка образцов для анализа

Анализируемый образец (3.7 мг) растворен в 1 мл воды (ожидаемая концентрация соматотропина 3.7 мг/мл)

Образец растворился хорошо, с образованием прозрачного раствора. В анализируемом образце образовалось небольшое количество пены, что обычно для концентрированных белковых растворов (рисунок 2).

Джинтропин2

Рисунок 2 – Вид анализируемого образца (дно флакона после растворения в воде и взбалтывания), после растворения в воде (ожидаемая конечная концентрация 3.7 мг/мл). Анализируемый образец заметно пенится, что характерно для белковых растворов.

Электронная спектроскопия

Для полученного образца (раствор с ожидаемой концентрацией 3.7 мг/мл) записан спектр поглощения (длина оптического пути 1 мм). Результаты представлены на рисунке 3. В спектре присутствует поглощение при длине волны 280 нм, что свидетельствует о наличии веществ пептидной/белковой природы. Поглощение при длине волны равно 0.231. Для препарата Humatrope, ранее подвергнутого анализу, поглощение раствора с концентрацией 10 мг/мл равно 0.837. Концентрация в исследуемом растворе равна 0.231/0.837х10=2.8 мг/мл, что соответствует содержанию 2.8 мг/мл.

 

 Джинтропин3

Рисунок 3 – Электронный спектр поглощения водного раствора образца соматотропина (ожидаемая концентрация 3,7 мг/мл, расчетная концентрация 2.8 мг/мл).

 

Масс-спектрометрия образцов

Пробоподготовка:

К 1500 мкл смеси ACN:H2O (1:1), содержащей 2% муравьиной кислоты добавляли 4 и 10 мкл раствора образца с ожидаемой концентрацией 3.7 мг/мл, получая растворы с концентрацией 10 и 25 мкл/мл, соответственно.

Соответствующие масс-спектры представлены на рисунках 4-5. Используя последовательность соматотропина (из базы данных DrugBank) и программу QualBrowser из пакета Xcalibur проведена симуляция ESI масс-спектра соматотропина (параметры: adduct — H, charge: most abundant=17, half width=3), представленная на рисунке 5. Сравнение рисунков 4 и 6 подтверждает наличие в анализируемом образце соматотропина.

 Джинтропин4

Рисунок 4 – Масс-спектр анализируемого образца (ожидаемая концентрация 25 мкг/мл, объем инжекторной петли 2 мкл)

 Джинтропин5

Рисунок 5 – Масс-спектр анализируемого образца (ожидаемая концентрация 10 мкг/мл, объем инжекторной петли 2 мкл)

Для симуляции масс-спектров использовали аминокислотную последовательность соматотропина (рекомбинантный соматотропин человека) из БД DrugBank:

FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF

 

 Джинтропин6

Рисунок 6 – Компьютерная симуляция масс-спектра соматотропина с использованием в качестве исходных данных последовательности из БД DrugBank (http://www.drugbank.ca/drugs/DB00052), основной ион +17 соответствует m/z 1302,48.

Электрофорез

Проведен электрофорез в 12% ПААГ в денатурирующих условиях.

Подготовка образцов: 0.1, 0.5, 1, 2.5, 5, 10, 15 мкл водного раствора (10 мг/мл)+30 мкл восстанавливающего буфера для нанесения. На дорожку 15 мкл полученной смеси.

Результат электрофореграмма представленная на рисунке 7. В контрольном образце видна четкая полоса, соответствующая соматотропину. В анализируемом образце соматотропин отсутствует, отсутствуют также и другие соединения белковой и пептидной природы.

 

 

Джинтропин7

Рисунок 7 – Электрофореграмма анализируемого образца соматотропина. На дорожки слева направа нанесены стандарты молекулярных масс белков и анализируемый образец соматотропина в повышающихся концентрациях.

 

Заключение

Для анализа соматотропина в образце использованы методы электронной спектроскопии, масс-спектрометрии и электрофореза. Для сравнения использовались результаты анализа препарата соматотропина Humatrop, 12 mg (Eli Lilly Benelux) (2013.01.25). В анализируемом образце присутствует соматотропин. Содержание соматотропина в анализируемом флаконе составляет 2.8 мг, что соответствует 7,5 ед. вместо заявленных 10 ед.